Proč společnost BGI vybrala ORF1ab jako cílovou sekvenci pro detekci 2019-nCoV?

Po analýze sekvence celého genomu nového koronavirusu, Národní čínská zdravotní komise doporučila tři specifické oblasti (ORF1ab, E, N) viru pro návrh PCR primerů. Když je vyvíjen kit pro detekci 2019-nCov, primer může být navržen na základě kterékoli z těchto tří oblastí a není nutné testovat všechny tři oblasti současně.

Samotný gen N je relativně konzervovaný u koronavirů a dochází ke zkřížené reaktivitě s jinými koronaviry, zejména s koronaviry, jako je 229E, OC43 a HKU-1, které existují v přirozeném oběhu a infikují člověka, ale mají špatnou přenositelnost, což vede k nesprávné diagnóze. Aby se předešlo zkřížené reaktivitě s jinými patogeny, je důležité najít specifické oblasti 2019-nCoV pomocí bioinformatických analýz. BGI identifikovala specifické oblasti v genomu 2019-nCoV, hlavně se zaměřením na geny ORF1ab a S, a vyvinula detekční systém pro 2019-nCoV s robustním a nejlepším výkonem screeningu a vyhodnocení. Současně BGI vyrobila detekční systém specifický pro detekci N genu a praktický test ukázal, že mezi koronaviry skutečně existuje zkřížená reaktivita. To znamená, že když by byl N gen vybrán jako cílová sekvence pro detekci 2019-nCoV, další koronaviry by byly také falešně pozitivní.

Proto BGI vybrala ORF1ab jako cílovou sekvenci pro detekci nového koronavirusu a 26. ledna 2020 získala regulační certifikaci od National Medical Products Administration (NMPA) a 2. března 2020 značku CE IVD.

 

Proč BGI testuje pouze jeden gen?

Specifičnost a účinnost primer-sonda systému udává výkon qPCR kitu, který je také hlavním faktorem pro efekt kvality různých výrobců. Výběr vhodné cílové oblasti vyžaduje dobrou referenční sekvenci a bohaté biologické informace. BGI byla jednou z prvních institucí, které detekovaly 2019-nCoV ve Wu-chanu. Poprvé získala celý genom virusu, což poskytlo efektivní způsob, jak vyvinout citlivý a specifický RT-PCR kit. Mezitím bohaté bioinformatické schopnosti BGI umožňují získat cílovou oblast vhodnou pro návrh primerů a sondy.

Dalším faktorem, který určuje kvalitu produktu - stabilní procesní systém. Díky mnohaletým zkušenostem ve vývoji in vitro diagnostických reagencií, společnost BGI vytvořila vysoce účinný a stabilní procesní systém. Právě díky výhodám výše uvedených aspektů má detekční kit od BGI dobrý analytický výkon, který prošel přezkoumáním State Food and Drug Administration a získal osvědčení o registraci zdravotnických prostředků.

Geny, které mohou účinně identifikovat 2019-nCoV, jsou hlavně genové oblasti orf1ab a S, takže není nutné detekovat dva geny současně. Například obvykle testujeme jeden specifický gen na HIV a HBV. Navíc N gen je ve skutečnosti konzervovaný gen a nemůže účinně identifikovat 2019-nCoV, protože bude zkříženě reagovat s jinými koronaviry.

Více genů není nutně lepší pro detekci patogenů. Primery a sondy budou ve skutečnosti navzájem interferovat, což povede ke snížení citlivosti, ve kterém bude duplexní PCR slabší než jednoplexní PCR a triplexní PCR bude nižší než duplexní. V současné době jsou metody detekce více patogenních nukleových kyselin pohodlné a snadno použitelné, ale kvůli vzájemné interferenci je citlivost multiplexní PCR výrazně nižší než citlivost jediné detekce. Například citlivost multiplexní PCR detekující EV (enterický virus) je pouze asi 80% v porovnání s PCR detekující jediný marker.

Podle posledních klinických výsledků Čína identifikovala gen orf1ab jako specifický diagnostický cílový gen pro 2019-nCoV. Ve všech výrobcích schválených NMPA se orf1ab používá jako cíl pro konečné stanovení 2019-nCoV, N a E se používají jako doplňující geny. Je také zřejmé, že jiné koronavirové infekce nejsou vyloučeny, pokud je E nebo N použit jako cílový gen pro detekci. V praxi je potřeba zohlednit konzervativnost při navrhování primerů pro N gen, což také ovlivňuje citlivost klinické diagnózy. V některých případech byl úspěšně amplifikován pouze gen orf1ab a gen N selhal, což také ovlivnilo správnou interpretaci výsledků.

Porovnání různých metod

 

	3 geny（N, E, ORF1ab） testované v 1 reakci	3 reakce (N-E- ORF1ab）	BGI （ORF1ab）
Doba reakce	3hod	10hod	3hod
Náklady	normální	vysoké	normální
LOD	vysoké	normální	normální
Pozitivní procento shody	nízké	normální	normální
Falešně negativní míra	vysoká	normální	normální

 

 

1. Velké množství detekční kapacity musí být poskytnuto co nejdříve po propuknutí epidemie, v tomto směru je výhodný komerční kit pro jednokrokovou reakci.

2. Kit BGI RT-PCR byl testován na více než 1 milionu vzorků. Vykazuje dobrý klinický výkon a byl validován velkým počtem vzorků.